Richiami di struttura e funzione delle macromolecole Mutazioni. Effetti delle mutazioni: la patologia dei vari tipi di alterazione Nomenclatura delle mutazioni. Cenni di bioinformatica Principali database e ricerca di informazioni. Utilizzo dei principali database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.ensembl.org/) per le applicazioni di diagnostica molecolare. Estrazione DNA e RNA Fase preanalitica e preparazione del campione. Estrazione acidi nucleici: metodi manuali e commerciali. L’automazione nel lab. di biologia molecolare diagnostica. Concentrazione acidi nucleici e valutazione della qualità tramite tecniche spettrofotometriche classiche e micrometodi. P Mutazioni alla base della patologia genetica umana: nomenclatura secondo le linee guida più recenti  Organizzazione del laboratorio di diagnostica molecolare.  Accettazione del campione e verifica dell’appropriatezza.  Estrazione acidi nucleici: metodi manuali e automatizzati, funzionamento di un estrattore automatizzato.  Preparazione del campione: PCR: limiti e controlli di qualità nel laboratorio diagnostico. Funzionamento del termociclatore  Verifica di contaminazioni: elettroforesi ed elettroforesi automatizzata acidi nucleici  Tecniche di analisi per le patologie causate da delezioni intrageniche dei cromosomi sessuali maschili: esempio delle microdelezioni dell’Y e della Distrofia Muscolare Duchenne/Becher  Diagnostica molecolare delle patologie causate da una o poche mutazioni: esempio dell’anemia falciforme, emocromatosi, malattie mitocondriali. Analisi di restrizione protocolli applicativi e controlli di qualità interni  La diagnosi di laboratorio di malattie mendeliane classiche : o La fibrosi cistica: lo screening neonatale, il test del sudore, l’analisi molecolare tramite tecniche di primo livello basate sulla PCR-ARMS, Reverse dot Blot, PCR-OLA o La fenilchetonuria: test di screening e di conferma o I test di secondo livello: sequenziamento e funzionamento di un sequenziatore a elettroforesi capillare. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione  La RealTime PCR applicata alla genotipizzazione: Applicazioni all’analisi molecolare per trombofilia.  Metodi diagnostici per l’analisi di espansioni di triplette: la PCR e il Southern Blot applicati alla diagnosi di X-fragile.

Dispense fornite dal docente

Modulo: DIAGNOSTICA MOLECOLARE SU TESSUTO • Marcatori tumorali, diagnostici, prognostici, predittivi, appropriatezza clinica di un biomarker; gold standard nella diagnosi di: neoplasie cerebrali, neoplasie polmonari, neoplasie intestino e colon, neoplasie tratto urinario, neoplasie linfoidi, neoplasie mieloidi, neoplasie mammarie. • Analisi di biomarcatori proteici nei tessuti: immunoistochimica, automazione, cut-off e quantificazione. • Analisi di biomarcatori genetici in situ: FISH, CISH, SISH. • Tissue microarray, laser capture, automazione dell’estrazione di acidi nucleici da tessuto. • Biomarcatori genetici in DNA estratto da tessuto: Real Time-PCR, Reverse Transcription PCR, Analisi di secondo (sequenziamento Sanger) e terzo livello (MLPA e analisi dei trascritti). • Epigenetica, Methylation Specific-PCR, Pyrosequencing, MS-MLPA, methylation profiling. • Gene expression profiling, RNA In Situ Hybridization, Analisi di microRNA da tessuto. • comparazione tra metodiche analitiche diverse nell’analisi dello stesso biomarcatore, rapporto costo-beneficio nell’impiego delle diverse tecnologie, efficienza diagnostica, intervalli di riferimento. • Principi analitici, sensibilità e specificità, efficienza analitica, variabili, interferenze ed errori, calibrazioni, controlli di qualità, standardizzazione e ottimizzazione. • Biobanche di tessuti. Modulo:METODOLOGIA DIAGNOSTICA MOLECOLARE  Breve ricapitolazione della patologia genetica. Revisioni delle principali acquisizioni in biologia molecolare/genetica molecolare.  Metodi tradizionali ed innovativi per la rilevazione di aberrazioni cromosomiche di numero e strutturali.  Metodi tradizionali ed innovativi per la rilevazione di riarrangiamenti del DNA.  Metodi tradizionali ed innovativi per la rilevazione di mutazioni puntiformi.  Set-up di screening mutazionali per specifiche patologie.  Evoluzione delle metodologie di sequenziamento.  Applicazione degli screening mutazionali alla patologia umana con particolare attenzione alla patologia oncologica.  Approcci di screening molecolari ad alta produttività alla diagnostica molecolare oncologica. Modulo:SCIENZE TECNICHE DI MEDICINA DI LABORATORIO  Mutazioni alla base della patologia genetica umana: nomenclatura secondo le linee guida più recenti.  Organizzazione del laboratorio di diagnostica molecolare.  Accettazione del campione e verifica dell’appropriatezza.  Estrazione acidi nucleici: metodi manuali e automatizzati, funzionamento di un estrattore automatizzato.  Preparazione del campione: PCR: limiti e controlli di qualità nel laboratorio diagnostico. Funzionamento del termociclatore.  Verifica di contaminazioni: elettroforesi automatizzata acidi nucleici.  Tecniche di analisi per le patologie causate da delezioni intrageniche dei cromosomi sessuali maschili: esempio delle microdelezioni dell’Y e della Distrofia Muscolare Duchenne/Becher.  Diagnostica molecolare delle patologie causate da una o poche mutazioni: esempio dell’anemia falciforme, emocromatosi, malattie mitocondriali. Analisi di restrizione protocolli applicativi e controlli di qualità interni.  La diagnosi di laboratorio della fibrosi cistica: lo screening neonatale, il test del sudore, l’analisi molecolare tramite tecniche di primo livello basate sulla PCR-ARMS, Reverse dot Blot, PCR-OLA. I test di secondo livello: sequenziamento e funzionamento di un sequenziatore a elettroforesi capillare.  La RealTime PCR applicata alla genotipizzazione: Applicazioni all’analisi molecolare per trombofilia.  Metodi diagnostici per l’analisi di espansioni di triplette: la PCR e il Southern Blot applicati alla diagnosi di X-fragile.

Dispense fornite dai docenti Libri di testo (consigliati): L Ruco, A Scarpa, Anatomia Patologica Le Basi, UTET Qualunque libro di genetica umana integrato da letture sui seguenti testi: Molecular Diagnostic W. B. Coleman, G. J. Tsongalis Humana Press Introduzione alla Medicina Molecolare Ross Dennis W. Springer Human Molecular Genetics Strachan T, Read . P.