La prima parte del corso di Biologia Molecolare approfondisce aspetti relativi alla struttura, organizzazione, replicazione e mantenimento del materiale genetico. Al termine di questa parte del corso lo studente avrà anche appreso i meccanismi che regolano la trascrizione in procarioti ed eucarioti nonché il ruolo di alcuni RNA non codificanti nella regolazione post-trascrizionale. Vengono anche discusse alcune metodiche per l’analisi di acidi nucleici, il sequenziamento del DNA, lo studio dell’espressione genica nonché alcuni aspetti applicativi del RNA interference. STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI Costituenti chimici degli acidi nucleici: basi puriniche e pirimidiniche, ribosio e deossiribosio, nucleosidi e nucleotidi. DNA: il DNA come materiale genetico (esperimenti di Griffith, Avery-McLeod-McCarty, Hershey & Chase). Regole di Chargaff. La doppia elica di Watson e Crick (forma B), forme alternative (A, Z) ed altre strutture del DNA (tripla elica, cruciformi, forcine). Topologia del DNA: superavvolgimenti, numero di legame, topoisomerasi. RNA: differenze fra RNA e DNA. Strutture secondarie e terziarie dell’RNA. RNA catalitici: ribozimi. ORGANIZZAZIONE DEL DNA. Il cromosoma batterico. Cromatina e cromosomi eucariotici: centromeri e telomeri. Nucleosoma, istoni e codice istonico. Impacchettamento del DNA. Cenni sull’organizzazione dei genomi procariotici ed eucariotici. Genoma mitocondriale. Virus a DNA. Genomi ad RNA. REPLICAZIONE DEL DNA. Duplicazione del DNA: semiconservativa (esperimento di Meselson & Stahl), bidirezionale, semidiscontinua. Origini di replicazione in procarioti ed eucarioti. Meccanismo di replicazione del DNA nei procarioti: DNA polimerasi (fedeltà e processività) ed altri fattori coinvolti. Meccanismo di replicazione del DNA nelle cellule eucariotiche. Telomeri e telomerasi: ruolo nella replicazione del DNA, nell’invecchiamento e nel cancro. Replicazione del DNA e ciclo cellulare. RIPARAZIONE DEL DNA. Mutazioni: mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni. Classi generali di danni al DNA: deamminazioni, depurinazioni, alchilazioni, dimeri di timina. Meccanismi di riparazione: riparazione diretta, riparazione per escissione (BER, NER), mismatch repair (MMR), riparazione delle rotture a doppio filamento (HR, NHEJ). Risposta cellulare ai danni al DNA. LA TRASCRIZIONE. Caratteristiche generali: inizio, allungamento e terminazione. TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI: RNA polimerasi e fattori sigma. Promotori procariotici ed inizio trascrizionale. Terminazione nei procarioti: terminatori intrinseci e rho-dipendenti. Regolazione trascrizionale nei procarioti: operoni inducibili e reprimibili, repressori e attivatori. L’operone lac: repressore lac e proteina CAP. Operone trp: attenuazione. Cenni sul fago lambda: ciclo litico e lisogenico ed elementi di regolazione del fago lambda. TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI: RNA polimerasi eucariotiche e loro promotori. Trascrizione di RNA polimerasi II: struttura dei promotori ed inizio trascrizionale. Fattori generali di trascrizione e mediatore. Allungamento e terminazione. Regolazione trascrizionale negli eucarioti: natura modulare dei promotori, enhancers e silencers. Motivi di legame al DNA dei fattori trascrizionali: helix-turn-helix, zinc finger, leucine zipper, helix-loop-helix. Trasduzione dei segnali ed attivazione trascrizionale. Metilazione del DNA. Isole CpG. Rimodellamento della cromatina. CONTROLLO POST-TRASCRIZIONALE: GLI RNA REGOLATORI. RNA regolatori nei procarioti: riboswitch e sequenze CRISPR. RNA regolatori negli eucarioti. I micro RNA: biogenesi, processamento e funzioni. siRNA, RNA interference (RNAi) e sue applicazioni. I long non coding RNA (lncRNA). Gli RNA circolari (cRNA). TECNICHE. Proprietà del DNA: spettro di assorbimento, denaturazione, rinaturazione, effetto ipercromico e temperatura di fusione (Tm) di un DNA. Southern e Northern blot, sonde, ibridazione. Colony hybridization. Microarrays. Il sequenziamento del DNA: il metodo di Sanger ed il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Inibizione gene-specifica mediante tecnologia antisenso e interferenza ad RNA. Nella seconda parte del corso di Biologia Molecolare sono illustrati i meccanismi alla base della maturazione dell’RNA, della traduzione e della sua regolazione. Sono inoltre presentate le principali tecnologie del DNA ricombinante e metodiche per lo studio dell’interazione tra macromolecole biologiche. MATURAZIONE DELL’RNA. Processamento di rRNA e tRNA in procarioti ed eucarioti. Ribozimi a testa di martello. Principali modificazioni chimiche di ribonucleotidi e loro funzione in tRNA e rRNA (gli snoRNA). Il processo di ‘capping’ di mRNA eucariotici: meccanismi e funzioni. La poliadenilazione di mRNA eucariotici: meccanismi e funzioni. Lo splicing dell’RNA. Splicing nucleare e spliceosoma. Autosplicing (introni di gruppo I e gruppo II). Splicing di tRNA. Trans-splicing. Lo splicing alternativo. Regolazione dello splicing. Editing dell’RNA per conversione di basi e per inserzione di nucleotidi. Il trasporto nucleo-citoplasmatico degli RNA. IL CODICE GENETICO. Il dogma centrale di Crick. Cenni storici sulla decifrazione del codice genetico e formulazione dei concetti di ‘fase di lettura’ e ‘open reading frame’. Codoni di stop e mutanti soppressori. Struttura e proprietà del codice genetico (degenerazione del codice). Teoria del vacillamento. Origine ed evoluzione del codice genetico. TRADUZIONE. Struttura e assemblaggio del ribosoma (RNA e proteine ribosomiali, struttura tridimensionale). Struttura e funzione degli RNA transfer. Le amminoacil-tRNA sintetasi e il caricamento degli amminoacil-tRNA. L’attività di correzione delle bozze delle amminoacil-tRNA sintetasi. I fattori di traduzione. Inizio della traduzione. Fase di allungamento e attività peptidil-transferasica. Traslocazione. Fase di terminazione. La traduzione negli eucarioti e le differenze con i procarioti. CONTROLLO TRADUZIONALE E POST-TRADUZIONALE. Regolazione generale della traduzione in procarioti (risposta stringente) ed eucarioti. Regolazione della traduzione di geni specifici (controlli traduzionali autogeni e non). Degradazione dell’mRNA in procarioti ed eucarioti (l’elemento ARE). Meccanismi di controllo di qualità dell’mRNA (Non-sense Mediated Decay. NMD). Trasporto e localizzazione degli mRNA. STABILITA’, PROCESSAMENTO E REGOLAZIONI POST-TRADUZIONALI DI PROTEINE. Chaperoni molecolari. Proteasi e proteasoma. Principali modifiche post-traduzionali di proteine: ubiquitinazione, sumoilazione, fosforilazione, acetilazione, metilazione, glicosilazione, modificazioni lipidiche. TECNICHE TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE. Principali classi di enzimi di restrizione. Clonaggio molecolare (vettori e plasmidi, tecniche di trasformazione). Librerie di cDNA, banche genomiche. Produzione di proteine ricombinanti in sistemi batterici, animali e vegetali. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e sue applicazioni. INTERAZIONE TRA MACROMOLECOLE BIOLOGICHE. Interazioni proteina-DNA: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), DNA footprinting, immunoprecipitazione della cromatina, Surface Plasmon Resonance (SPR), Atomic Force Microscopy (AFM). Interazione proteina-proteina: metodi genetici, metodi biochimici (co-purificazione, co-sedimentazione, co-localizzazione e co-immunopreciptazione accoppiate a spettrometria di massa), SPR, Green Fluorescent Protein (GFP), trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET), doppio ibrido.

1. Amaldi A. et al. BIOLOGIA MOLECOLARE Terza Edizione Casa Editrice Ambrosiana 2018 2. Watson J.D. et al. BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE Settima Edizione Zanichelli 2015 3. Eventuale materiale didattico aggiuntivo/integrativo su e-learning2

La prima parte del corso di Biologia Molecolare approfondisce aspetti relativi alla struttura, organizzazione, replicazione e mantenimento del materiale genetico. Al termine di questa parte del corso lo studente avrà anche appreso i meccanismi che regolano la trascrizione in procarioti ed eucarioti nonché il ruolo di alcuni RNA non codificanti nella regolazione post-trascrizionale. Vengono anche discusse alcune metodiche per l’analisi di acidi nucleici, il sequenziamento del DNA, lo studio dell’espressione genica nonché alcuni aspetti applicativi del RNA interference. STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI Costituenti chimici degli acidi nucleici: basi puriniche e pirimidiniche, ribosio e deossiribosio, nucleosidi e nucleotidi. DNA: il DNA come materiale genetico (esperimenti di Griffith, Avery-McLeod-McCarty, Hershey & Chase). Regole di Chargaff. La doppia elica di Watson e Crick (forma B), forme alternative (A, Z) ed altre strutture del DNA (tripla elica, cruciformi, forcine). Topologia del DNA: superavvolgimenti, numero di legame, topoisomerasi. RNA: differenze fra RNA e DNA. Strutture secondarie e terziarie dell’RNA. RNA catalitici: ribozimi. ORGANIZZAZIONE DEL DNA. Il cromosoma batterico. Cromatina e cromosomi eucariotici: centromeri e telomeri. Nucleosoma, istoni e codice istonico. Impacchettamento del DNA. Cenni sull’organizzazione dei genomi procariotici ed eucariotici. Genoma mitocondriale. Virus a DNA. Genomi ad RNA. REPLICAZIONE DEL DNA. Duplicazione del DNA: semiconservativa (esperimento di Meselson & Stahl), bidirezionale, semidiscontinua. Origini di replicazione in procarioti ed eucarioti. Meccanismo di replicazione del DNA nei procarioti: DNA polimerasi (fedeltà e processività) ed altri fattori coinvolti. Meccanismo di replicazione del DNA nelle cellule eucariotiche. Telomeri e telomerasi: ruolo nella replicazione del DNA, nell’invecchiamento e nel cancro. Replicazione del DNA e ciclo cellulare. RIPARAZIONE DEL DNA. Mutazioni: mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni. Classi generali di danni al DNA: deamminazioni, depurinazioni, alchilazioni, dimeri di timina. Meccanismi di riparazione: riparazione diretta, riparazione per escissione (BER, NER), mismatch repair (MMR), riparazione delle rotture a doppio filamento (HR, NHEJ). Risposta cellulare ai danni al DNA. LA TRASCRIZIONE. Caratteristiche generali: inizio, allungamento e terminazione. TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI: RNA polimerasi e fattori sigma. Promotori procariotici ed inizio trascrizionale. Terminazione nei procarioti: terminatori intrinseci e rho-dipendenti. Regolazione trascrizionale nei procarioti: operoni inducibili e reprimibili, repressori e attivatori. L’operone lac: repressore lac e proteina CAP. Operone trp: attenuazione. Cenni sul fago lambda: ciclo litico e lisogenico ed elementi di regolazione del fago lambda. TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI: RNA polimerasi eucariotiche e loro promotori. Trascrizione di RNA polimerasi II: struttura dei promotori ed inizio trascrizionale. Fattori generali di trascrizione e mediatore. Allungamento e terminazione. Regolazione trascrizionale negli eucarioti: natura modulare dei promotori, enhancers e silencers. Motivi di legame al DNA dei fattori trascrizionali: helix-turn-helix, zinc finger, leucine zipper, helix-loop-helix. Trasduzione dei segnali ed attivazione trascrizionale. Metilazione del DNA. Isole CpG. Rimodellamento della cromatina. CONTROLLO POST-TRASCRIZIONALE: GLI RNA REGOLATORI. RNA regolatori nei procarioti: riboswitch e sequenze CRISPR. RNA regolatori negli eucarioti. I micro RNA: biogenesi, processamento e funzioni. siRNA, RNA interference (RNAi) e sue applicazioni. I long non coding RNA (lncRNA). Gli RNA circolari (cRNA). TECNICHE. Proprietà del DNA: spettro di assorbimento, denaturazione, rinaturazione, effetto ipercromico e temperatura di fusione (Tm) di un DNA. Southern e Northern blot, sonde, ibridazione. Colony hybridization. Microarrays. Il sequenziamento del DNA: il metodo di Sanger ed il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Inibizione gene-specifica mediante tecnologia antisenso e interferenza ad RNA. Nella seconda parte del corso di Biologia Molecolare sono illustrati i meccanismi alla base della maturazione dell’RNA, della traduzione e della sua regolazione. Sono inoltre presentate le principali tecnologie del DNA ricombinante e metodiche per lo studio dell’interazione tra macromolecole biologiche. MATURAZIONE DELL’RNA. Processamento di rRNA e tRNA in procarioti ed eucarioti. Ribozimi a testa di martello. Principali modificazioni chimiche di ribonucleotidi e loro funzione in tRNA e rRNA (gli snoRNA). Il processo di ‘capping’ di mRNA eucariotici: meccanismi e funzioni. La poliadenilazione di mRNA eucariotici: meccanismi e funzioni. Lo splicing dell’RNA. Splicing nucleare e spliceosoma. Autosplicing (introni di gruppo I e gruppo II). Splicing di tRNA. Trans-splicing. Lo splicing alternativo. Regolazione dello splicing. Editing dell’RNA per conversione di basi e per inserzione di nucleotidi. Il trasporto nucleo-citoplasmatico degli RNA. IL CODICE GENETICO. Il dogma centrale di Crick. Cenni storici sulla decifrazione del codice genetico e formulazione dei concetti di ‘fase di lettura’ e ‘open reading frame’. Codoni di stop e mutanti soppressori. Struttura e proprietà del codice genetico (degenerazione del codice). Teoria del vacillamento. Origine ed evoluzione del codice genetico. TRADUZIONE. Struttura e assemblaggio del ribosoma (RNA e proteine ribosomiali, struttura tridimensionale). Struttura e funzione degli RNA transfer. Le amminoacil-tRNA sintetasi e il caricamento degli amminoacil-tRNA. L’attività di correzione delle bozze delle amminoacil-tRNA sintetasi. I fattori di traduzione. Inizio della traduzione. Fase di allungamento e attività peptidil-transferasica. Traslocazione. Fase di terminazione. La traduzione negli eucarioti e le differenze con i procarioti. CONTROLLO TRADUZIONALE E POST-TRADUZIONALE. Regolazione generale della traduzione in procarioti (risposta stringente) ed eucarioti. Regolazione della traduzione di geni specifici (controlli traduzionali autogeni e non). Degradazione dell’mRNA in procarioti ed eucarioti (l’elemento ARE). Meccanismi di controllo di qualità dell’mRNA (Non-sense Mediated Decay. NMD). Trasporto e localizzazione degli mRNA. STABILITA’, PROCESSAMENTO E REGOLAZIONI POST-TRADUZIONALI DI PROTEINE. Chaperoni molecolari. Proteasi e proteasoma. Principali modifiche post-traduzionali di proteine: ubiquitinazione, sumoilazione, fosforilazione, acetilazione, metilazione, glicosilazione, modificazioni lipidiche. TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE. Principali classi di enzimi di restrizione. Clonaggio molecolare (vettori e plasmidi, tecniche di trasformazione). Librerie di cDNA, banche genomiche. Produzione di proteine ricombinanti in sistemi batterici, animali e vegetali. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e sue applicazioni. INTERAZIONE TRA MACROMOLECOLE BIOLOGICHE. Interazioni proteina-DNA: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), DNA footprinting, immunoprecipitazione della cromatina, Surface Plasmon Resonance (SPR), Atomic Force Microscopy (AFM). Interazione proteina-proteina: metodi genetici, metodi biochimici (co-purificazione, co-sedimentazione, co-localizzazione e co-immunopreciptazione accoppiate a spettrometria di massa), SPR, Green Fluorescent Protein (GFP), trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET), doppio ibrido.

1. Amaldi A. et al. BIOLOGIA MOLECOLARE Terza Edizione Casa Editrice Ambrosiana 2018 2. Watson J.D. et al. BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE Settima Edizione Zanichelli 2015 3. Eventuale materiale didattico aggiuntivo/integrativo su e-learning2