Docente
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CARDUCCI CARLA
(programma)
Richiami di struttura e funzione delle macromolecole
Mutazioni. Effetti delle mutazioni: la patologia dei vari tipi di alterazione
Nomenclatura delle mutazioni.
Cenni di bioinformatica
Principali database e ricerca di informazioni. Utilizzo dei principali database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.ensembl.org/) per le applicazioni di diagnostica molecolare.
Estrazione DNA e RNA
Fase preanalitica e preparazione del campione. Estrazione acidi nucleici: metodi manuali e commerciali. L’automazione nel lab. di biologia molecolare diagnostica. Concentrazione acidi nucleici e valutazione della qualità tramite tecniche spettrofotometriche classiche e micrometodi.
PCR: principi e applicazioni alla patologia molecolare diagnostica.
Organizzazione del laboratorio. Rischi di contaminazioni e strategie per evitarli. Controlli di qualità.
Elettroforesi acidi nucleici, metodi classici e semi-automatizzati. Metodi di colorazione
Elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare degli acidi nucleici: Principi e strumentazione
Tecniche di indagine di mutazioni note e applicazioni
Uso della PCR nella diagnosi di patologie causate da microdelezioni:
- microdelezioni del cromosoma Y
- analisi delle delezioni esoniche nella Distrofia Muscolare Duchenne/Becker
PCR-ARMS
- Principio del metodo. Sensibilità e specificità. Applicazioni.
Analisi di restrizione
- Enzimi di restrizione. Come le endonucleasi riconoscono una mutazione. Metodi di rilevazione. Sensibilità e specificità. Applicazioni (anemia falciforme, emocromatosi, malattie mitocondriali) Analisi di restrizione con la tecnica “PCR-mediated site direct mutagenesis”
Tecniche di ibridazione
- Principi. Marcatura delle sonde., Dot/slot blot.
Diagnosi di fibrosi cistica
- Test biochimici e molecolari. Screening neonatale, Test del sudore, tecniche molecolari: tecniche utilizzate per l’analisi di mutazioni più frequenti (RBD, PCR-ARMS,),sensibilità e specificità.
Real Time PCR : utilizzo del metodo per il genotyping: esempio :diagnosi molecolare delle trombofilie ereditarie
Malattie da espansioni di triplette: PCR e Southern Bolt. Applicazioni all’X-Fragile e alla m. di Huntington
Ricerca di mutazioni non note
Analisi di SNPs tramite sequenziamento diretto: metodi, marcature e funzionamento della strumentazione automatizzata. Lettura degli elettroferogrammi e interpretazione dl risultato.
Test di secondo livello per Fibrosi Cistica.
Diagnosi di malattie metaboliche ereditarie: l’esempio della fenilchetonuria e della galattosemia, test di screening e test di conferma
Tecnica MLPA per analisi di delezioni/duplicazioni esoniche presenti in eterozigosi
Cenni sulle tecniche di sequenziamento di nuova generazione
Dispense fornite dal docente
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