Tecniche di base 1) Tecniche di base di Biologia Molecolare Introduzione al corso. Isolamento e purificazione di DNA e RNA. Manipolazione e quantificazione degli acidi nucleici. Elettroforesi su gel. 2) Taglio e ligazione di molecole di DNA Enzimi e strategie usate nei clonaggi. Enzimi di restrizione. Ligasi. Enzimi alternativi alla ligasi. Il sistema Gateway. 3) La PCR PCR. Principi di base e uso in biologia molecolare. Applicazioni mediche. Applicazioni forensi. 4) Applicazioni della PCR Applicazioni mediche e applicazioni forensi della PCR 5) Vettori di clonaggio Vettori plasmidici. Trasformazione di cellule procariotiche ed eucariotiche. Vettori derivati dal batteriofago λ. 6) Selezione e analisi di cloni ricombinanti Selezione dei plasmidi ricombinanti. Marcatori di selezione. Substrati cromogenici. Inattivazione inserzionale. Marcatura degli acidi nucleici. Ibridazioni molecolari. Screening di librerie geniche 7) Librerie geniche Librerie genomiche. Librerie di cDNA. Sintesi di cDNA. Selezione dei batteriofagi ricombinanti. 8) Strategie di clonaggio Strategie di clonaggio. Librerie di espressione. Ibridazioni differenziali. Librerie di sottrazione. Screening immunologici. Chromosome Walking. Analisi di espressione 9) Analisi di espressione Generalità. Vettori di espressione procariotici. Western blot. 10) Metodi di studio della regolazione dell'espresione genica Analisi dei livelli di espressione del mRNA (northern blot, RT-PCR. Real-time qRT- PCR). Analisi dei promotori (geni reporter, ChIP, ChIP-on-chip). Analisi delle Interazioni molecolari acidi nucleici-proteine (DNA footprinting, gelshift) e proteine- proteine, (two hybrid system). 11) Mutagenesi sito-specifica Mutagenesi per estensione del primer. Mutagenesi dut-, ung-. Mutagenesi mediante PCR. Ingegneria genetica delle piante 12) Ingegneria genetica delle piante Il sistema Agrobacterium. Tecniche di trasformazione basate su Agrobacterium. Rigenerazione di piante trasgeniche. Tecniche di trasformazione alternative. 13) Selezione e analisi di piante trasgeniche Marcatori di selezione. Piante resistenti ad erbicidi. Sovraespessione. Espressione di geni in versione antisenso. RNA interference. 14) Genetica diretta e inversa Sistemi modello. Genetica diretta e inversa. Generazione e utilizzo di mutanti. Librerie di mutanti. Tilling. Genome Editing. Analisi genomiche e post-genomiche 15) Sequenziamento del DNA Sequenziamento del DNA. Genomica funzionale. Next generation sequencing. 16) Analisi genomiche e cenni di Bioinformatica Trascrittomica. DNA microarrays. RNA-seq. Strumenti informatici per la biologia molecolare. Risorse in rete. Interrogazione di banche dati.

Testo di riferimento: "Dai geni ai genomi” di Jeremy W. Dale, Malcom von Schantz e Nick Plant. 3^ edizione italiana, EdiSES, 2013 oppure: “Biotecnologie molecolari ” di Terry A. Brown. 2^ edizione italiana, Zanichelli, 2017 Materiale didattico integrativo e dispense del corso sono disponibili per gli studenti iscritti al corso sulla piattaforma Moodle2, alla pagina relativa al corso di Biotecnologie Ricombinanti.

La biologia molecolare dalle origini ai nostri giorni: il DNA come materiale genetico; il dogma centrale e il codice genetico. Il metodo scientifico La struttura del DNA. La replicazione del DNA: La fase d’inizio della replicazione, meccanismi di replicazione. La mutabilità e la riparazione del DNA: sistemi di riparazione. La ricombinazione: modelli di ricombinazione omologa; ricombinazione sito-specifica e trasposizione. L'espressione genica nei procarioti: struttura e funzioni dell’ RNA; trascrizione e traduzione. Regolazione del funzionamento dei geni nei procarioti: i diversi livelli di regolazione dell’espressione genica; meccanismi di regolazione nei procarioti; operoni lattosio e triptofano. Cenni sulle principali tecniche descritte in questo corso: cristallografia a raggi X, centrifugazione su gradiente di densità, northern, western, southern, ibridazione in situ, sequenziamento di nuova generazione, Dnasi e immunoprecipitazione Il genoma eucariotico: quantita' di DNA, DNA ripetitivo, geni interrotti. Funzionamento del genoma eucariotico: il nucleo eucariotico, la cromatina; sintesi e maturazione degli RNA; lo splicing degli introni. Regolazione dell'espressione genica in organismi superiori; modificazioni della cromatina ed espressione del genoma; regolazione dell'inizio della trascrizione; interazioni DNA-proteine; controllo post-trascrizionale: gli RNA nella regolazione genica, lo splicing alternativo Analisi comparativa dei genomi e organismi modello (cenni).

Libro di testo: G. Capranico, E. Martegani, G. Musci, G. Raugei, T. Russo, N. Zambrano, V. Zappavigna - Biologia Molecolare, I Ed. Edises. Ulteriori libri consigliati: BIOLOGIA MOLECOLARE Amaldi Benedetti Pesole Plevani, III edizione 2018 , Zanichelli BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE. Watson et al. VII edizione Zanichelli 2015 IL GENE II. B. Lewin, edizione compatta Zanichelli. 2011, Biologia Molecolare. Zlatanova e van Holde. Zanichelli, 2018 Biologia molecolare della cellula, Alberts et al., Zanichelli 2016.